一、摘要

利用Liberty Blue™自動化微波多肽合成儀，通過微波增強的固相多肽合成（SPPS）技術，可以快速合成高純度的烴鍵合多肽。在不到4小時內，我們成功合成了一種促凋亡BID鍵合多肽衍生物，即BID SAHB（BCL-2結構域的穩定α螺旋）1，其純度達到了80%。同樣，一種促凋亡的BIM鍵合多肽，BIM SAHB2，也在不到4小時的時間內制備完成，純度同樣為80%。

二、介紹

肽鍵合是穩定α-螺旋的一種有效策略，而α-螺旋是決定各種肽和蛋白質生物活性的重要結構單元。³特別是碳氫鍵合技術已經成為一種強大的方法來穩定α-螺旋，已經產生了多個具有更高靶標親和力和顯著增強抗蛋白酶能力的肽例子。⁴此外，一些碳氫鍵合的肽被證明比其未鍵合的類似物具有更大的細胞通透性和體內活性^2,5，這進一步激發了將α-螺旋肽用于治療應用的努力。⁶

碳氫鍵合的肽可以通過使用側鏈末端帶有烯烴的氨基酸進行SPPS（固相多肽合成）制備，例如Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH（圖1左）⁷。在合成前綴鍵合的肽后，可以通過環閉合復分解反應（RCM）使用Grubbs催化劑™第一代（圖1右）⁷制備鍵合變體。傳統的室溫合成鍵合肽通常是一個耗時的過程，20個氨基酸長度的肽需要超過30小時的合成時間。將微波能量應用于碳氫鍵合肽的合成可以更有效地耦合，從而提高合成時間和高純度（CarboMAX）。⁸

圖1：（左）Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH；（右）Grubbs催化劑第一代

三、材料與方法

試劑

以下Fmoc氨基酸購自CEM公司（馬修斯，北卡羅來納州），并含有指示的側鏈保護基團：Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Glu(OtBu), Gln(Trt), His(Boc), Ser(tBu), Trp(Boc)和Tyr(tBu)。Rink Amide ProTide™LL樹脂也購自CEM公司。Grubbs催化劑^TM第一代、Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH、N,N’-二異丙基碳二亞胺（DIC）、哌啶、三氟乙酉夋（TFA）、3,6-二氧雜-1,8-辛二硫醇（DODT）、三異丙基硅烷（TIS）和醋酸酐（Ac₂O）購自Sigma-Aldrich（圣路易斯，密蘇里州）。1,2-二氯乙烷（DCE）購自Alfa Aesar（哈弗希爾，馬薩諸塞州）。二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、無水乙酉迷（Et₂O）、醋酸、高效液相色譜級水和乙腈購自VWR（西切斯特，賓夕法尼亞州）。LC-MS級水（H₂O）和LC-MS級乙腈（MeCN）購自Fisher Scientific（沃爾瑟姆，馬薩諸塞州）。

肽合成：BID SAHB, Ac-EDIIRNIARHLA(S5)VGD(S5)LDRSIW-NH₂

該肽（圖2）是在0.05mmol規模上使用CEM Liberty Blue自動化微波多肽合成儀制備的，使用了0.263克Rink Amide ProTide LL樹脂（0.19meq/g替代度）。Fmoc脫保護使用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure在DMF中進行。耦合反應使用5倍過量的0.2M Fmoc-AA與0.5M DIC和0.5M Oxyma Pure在DMF中進行（CarboMAX）。⁸Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH用于S5。乙酰化封端在E的Fmoc脫保護后使用10% Ac₂O在DMF中進行。環閉合復分解鍵合反應使用10mM Grubbs催化劑第一代（58mg）在DCE（7mL）中的溶液。切割使用CEM Razor™高通量多肽切割系統進行，切割液為92.5:2.5:2.5 TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，用Et₂O沉淀肽并過夜凍干。

圖2：碳氫鍵合的BID SAHB

肽合成：BIM SAHB, Ac-IWIAQELR(S5)IGD(S5)FNAYYARR-NH₂

該肽（圖3）是在0.05mmol規模上使用CEM Liberty Blue自動化微波多肽合成儀制備的，使用了0.263克Rink Amide ProTide LL樹脂（0.19meq/g替代度）。Fmoc脫保護使用20%哌啶和0.1M Oxyma Pure在DMF中進行。耦合反應使用5倍過量的0.2M Fmoc-AA與0.5M DIC和0.5M Oxyma Pure在DMF中進行（CarboMAX）。⁸Fmoc-(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸-OH用于S5。乙酰化封端在I的Fmoc脫保護后使用10% Ac₂O在DMF中進行。環閉合復分解鍵合反應使用10mM Grubbs催化劑第一代（58mg）在DCE（7mL）中的溶液。切割使用CEM Razor™高通量多肽切割系統進行，切割液為TFA/H₂O/TIS/DODT。切割后，用Et₂O沉淀肽并過夜凍干。

圖3：碳氫鍵合的BIM SAHB

肽分析

肽在配備PDA檢測器的Waters Acquity UPLC系統上進行分析，該系統裝有Acquity UPLC BEH C8柱（1.7微米和2.1 x 100毫米）。UPLC系統連接到Waters 3100單四極桿質譜儀用于結構測定。峰分析通過Waters MassLynx軟件完成。分離采用梯度洗脫，流動相為0.05% TFA在（i）H₂O和（ii）MeCN中的混合物。

四、結果

使用Liberty Blue自動化微波多肽合成儀進行微波增強的固相肽合成（SPPS），成功制備了BID SAHB目標肽，純度達到80%（圖4）。

圖4：BID SAHB的UPLC色譜圖

使用Liberty Blue自動化微波多肽合成儀進行微波增強的固相肽合成（SPPS），成功制備了BIM SAHB目標肽，純度達到80%（圖5）。

圖5：BIM SAHB的UPLC色譜圖

五、結論

使用微波增強的固相肽合成（SPPS）可以快速高效地合成碳氫鍵合肽。傳統的室溫下BID SAHB肽的合成需要超過35小時的合成時間來生成未鍵合的肽，并且還需要額外的3-6小時進行鍵合。⁷通過微波增強的SPPS，在不到4小時內即可合成純度為80%的鍵合肽。傳統的BIM SAHB肽的室溫合成需要33小時的人工操作時間，并且還需要額外的3-6小時進行鍵合。⁷另一方面，微波增強的SPPS在不到4小時內即可提供純度為80%的鍵合肽。